抗腫瘤免疫治療通過激活或增強(qiáng)患者的免疫系統(tǒng)來精確地攻擊腫瘤細(xì)胞，是一種革命性的腫瘤內(nèi)源性治療理念。然而，乳腺癌等免疫抑制實(shí)體瘤對于免疫治療仍然表現(xiàn)出較差的臨床反應(yīng)。這種免疫抑制生態(tài)位可以通過多種途徑扭轉(zhuǎn)，T細(xì)胞就在這一過程中起著核心作用。T細(xì)胞的持續(xù)激活依賴于cGAS-STING通路，該通路不僅在先天免疫中很重要，而且是適應(yīng)性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器。傳統(tǒng)的外源性STING激動劑在臨床應(yīng)用中存在明顯的局限性：一方面，帶負(fù)電荷的分子結(jié)構(gòu)阻礙了有效穿透細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)遞送效率不理想。另一方面，核酸酶的快速降解結(jié)合網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)介導(dǎo)的非特異性清除機(jī)制，顯著降低了治療藥物的體內(nèi)半衰期。研究表明，核膜完整性的破壞或線粒體功能障礙都將致使dsDNA的泄漏，這是觸發(fā)先天免疫的關(guān)鍵內(nèi)源性信號。這些內(nèi)源性dsDNA分子與cGAS蛋白的正電荷結(jié)構(gòu)域靜電相互作用，誘導(dǎo)cGAS的構(gòu)象變化。這導(dǎo)致一系列生化反應(yīng)和信號級聯(lián)反應(yīng)，最終驅(qū)動I型干擾素的表達(dá)。因此，通過激活dsDNA的釋放并結(jié)合免疫治療成為一種值得探索的策略。

近日，安徽醫(yī)科大學(xué)錢海生教授團(tuán)隊(duì)在國際期刊《ACS Nano》發(fā)表題為“Gelatin Methacryloyl Xerogel Puncture Implants Loaded with Cu0.5Mn2.5O4 Nanoparticles Synergizes Cuproptosis and STING Activation for Enhanced Breast Cancer Immunotherapy"的原創(chuàng)性論著。該研究通過可降解的腫瘤植入劑遞送納米顆粒實(shí)現(xiàn)了乳腺癌的免疫治療，同時(shí)為實(shí)體瘤的穿刺植入遞送藥物提供了一種實(shí)用策略。

首先，研究人員通過水熱法合成CMO納米顆粒，然后冷凍干燥備用。隨后制備植入劑，腫瘤植入劑的制備方法如圖1a所示，首先加熱與CMO納米顆粒和富馬酸單甲基（MMF）混合的GelMA水凝膠，然后將其添加到由摩方精密面投影立體光刻（PμSL）3D打印技術(shù)（nanoArch® S130，精度：2 μm）制備的模具中。水凝膠隨后進(jìn)行光交聯(lián)和冷凍干燥，得到CMF植入劑。CMO納米顆粒的透射電子顯微鏡（TEM）圖像顯示為均勻的空心球形結(jié)構(gòu)（圖1b），粒徑約為300 nm。X射線衍射（XRD）結(jié)果表明，所制備的CMO納米顆粒的特征峰與標(biāo)準(zhǔn)卡（Cu0.5Mn2.5O4, JCPDs 7-4367）的特征峰排列良好（圖1d）。手機(jī)圖像和掃描電鏡（SEM）圖像顯示，制備的植入劑具有一致的圓柱形，可以插入穿刺活檢針（圖1f-h）。如圖1j所示，將植入劑裝入針管，然后用柱塞將植入劑推入腫瘤。將與羅丹明B結(jié)合的植入劑植入小鼠腫瘤，并通過體內(nèi)成像觀察植入劑的降解情況。結(jié)果表明，植入劑在體內(nèi)至少保持了15天的緩慢降解，這對藥物的持續(xù)作用非常有利（圖1o）。

圖1.CMO納米顆粒和CMF植入劑的制備與表征。

隨后，通過透射電鏡觀察4T1細(xì)胞對CMO納米顆粒的攝取情況。CMO納米顆粒被內(nèi)化到細(xì)胞質(zhì)中，靠近線粒體（圖2a）。CCK-8檢測評估植入劑和材料對細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示，含CMO納米顆粒的種植體對4T1細(xì)胞活力的影響最為顯著，使4T1細(xì)胞活力僅為對照組的20%。此外，CMO納米顆粒和MMF對4T1細(xì)胞的活力都表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性（圖2b）。細(xì)胞周期分析顯示，在CMF植入劑處理的4T1細(xì)胞中，G1期細(xì)胞數(shù)量增加，G2/M期細(xì)胞數(shù)量明顯減少（圖2c，d）。細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，CMO 植入劑和CMF 植入劑處理可顯著提高4T1細(xì)胞的早期和晚期凋亡率，達(dá)到14.81%（圖2e，f）。然而，這一比例仍明顯低于CCK-8實(shí)驗(yàn)中觀察到的80%的抑制率，這表明CMO植入劑或CMF植入劑處理的4T1細(xì)胞可能會經(jīng)歷其他形式的細(xì)胞死亡。

為了檢測細(xì)胞內(nèi)銅離子濃度，將4T1細(xì)胞與不同濃度的CMO納米顆粒共孵育4小時(shí)后，再與羅丹明B酰肼（RBH）探針孵育30分鐘，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RBH的紅色熒光強(qiáng)度與CMO納米顆粒濃度呈正相關(guān)（圖2g）。這些發(fā)現(xiàn)表明，CMO納米顆粒在進(jìn)入細(xì)胞后釋放銅離子，這是誘導(dǎo)銅死亡的必要條件。銅離子可以引起線粒體損傷并改變線粒體膜電位，這可以用JC-1探針檢測。圖2i的結(jié)果顯示，CMO植入劑和CMF植入劑處理4T1細(xì)胞后，JC-1綠色熒光信號明顯增加，表明線粒體膜電位降低。CMO納米顆粒表現(xiàn)出優(yōu)異的GSH耗竭能力，GSH探針的熒光強(qiáng)度進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)（圖2j）。隨后評估CMF植入劑處理4T1細(xì)胞的耗氧率（OCR）。結(jié)果顯示，CMF植入劑處理的4T1細(xì)胞的基礎(chǔ)呼吸速率沒有顯著降低，而最大呼吸速率明顯降低（圖2k）。這一發(fā)現(xiàn)與銅死亡的特征一致。此外，與對照組相比，CMF植入劑處理后的4T1細(xì)胞線粒體明顯收縮，膜密度增加，線粒體嵴減少甚至消失，線粒體損傷嚴(yán)重（圖2l）。銅離子與乙酰化的TCA循環(huán)蛋白結(jié)合導(dǎo)致DLAT寡聚化，通過Western blot分析驗(yàn)證了這一點(diǎn)（圖2m）。

圖2. CMF植入劑誘導(dǎo)4T1細(xì)胞的凋亡和銅死亡。

為了闡明CMF植入劑影響4T1細(xì)胞的機(jī)制，研究人員對對照組和CMF植入劑組進(jìn)行了RNA轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）分析。Venn圖顯示，14029個(gè)基因在兩個(gè)細(xì)胞組中共表達(dá)，而1469個(gè)基因在CMF植入劑組中表達(dá)（圖3a）。兩組差異表達(dá)基因（DEGs）的火山圖顯示，351個(gè)基因上調(diào)，而364個(gè)基因下調(diào)（圖3b）。圖3c中的基因熱圖顯示了幾個(gè)顯著的基因變化，如與銅增生相關(guān)基因（Lias、Dld、Mt1/2、Slc30a1、Pdhb和Bcl2）和與cGAS-STING通路相關(guān)的基因（Cgas、Tbk1）的變化?；蚣患治觯℅SEA）顯示，在CMF植入劑處理的4T1細(xì)胞中，糖酵解明顯受到抑制，這可能是因?yàn)殂~死亡觸發(fā)了代謝重編程（圖3d）。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工顯著增加，這可能與激活cGAS-STING通路誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生密切相關(guān)（圖3e）。根據(jù)KEGG和GO分析，在CMF植入劑處理的細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、抗原加工和遞呈、cGMP-PKG信號通路、谷胱甘肽代謝過程、銅離子的應(yīng)激反應(yīng)和T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性被激活（圖3f，g）。綜上所述，RNA-seq結(jié)果揭示了CMF 植入劑處理后銅死亡激活的4T1細(xì)胞基因和cGAS-STING通路的轉(zhuǎn)錄變化。

圖2. CMF植入劑誘導(dǎo)4T1細(xì)胞的凋亡和銅死亡。

采用激光共聚焦雙光子成像系統(tǒng)觀察不同植體配方處理4T1細(xì)胞mtDNA的釋放情況，如圖4a所示。為了確定不同植入劑處理后4T1細(xì)胞釋放到細(xì)胞質(zhì)中的mtDNA的相對量，使用小鼠線粒體DNA染料熒光定量PCR試劑盒對釋放到細(xì)胞質(zhì)中的mtDNA進(jìn)行定量分析。值得注意的是，MMF 植入劑和CMO 植入劑組4T1細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中mtDNA含量約為對照組的5倍，而CMF 植入劑組細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中mtDNA含量高達(dá)對照組的17倍（圖4b）。這些結(jié)果表明MMF和CMO 納米顆粒都能積極影響mtDNA的釋放，并且它們的聯(lián)合使用會產(chǎn)生更明顯的效果。

CMO植入劑和CMF植入劑處理顯著增加了4T1細(xì)胞釋放的ATP，提高了細(xì)胞膜上CRT的表達(dá)，降低了細(xì)胞核中HMGB1的含量（圖4c-f），具有誘導(dǎo)免疫原性死亡的能力。并且在CMO植入劑和CMF植入劑處理的4T1細(xì)胞中，IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平顯著升高，有利于免疫細(xì)胞的募集（圖4g-i）。而IFN-β mRNA表達(dá)水平升高表明cGAS-STING通路激活，這與mtDNA的釋放密切相關(guān)（圖4j）。此外，這些細(xì)胞因子，特別是TNF-α和IL-6，促進(jìn)DC的成熟，這反過來有助于抗原呈遞和激活T細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤反應(yīng)。在CMO植入劑和CMF植入劑組中，BMDCs中IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA水平顯著升高（圖4l）。流式細(xì)胞術(shù)也顯示相應(yīng)處理后BMDCs的成熟度顯著提高（圖4m）。

圖4. CMF植入劑在體外誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)。

為了更詳細(xì)地探討CMF植入劑在乳腺癌中的作用機(jī)制，研究人員對CMF植入劑治療小鼠進(jìn)行了RNA-Seq分析。值得注意的是，CD274基因顯著下調(diào)，而PDCD1基因顯著上調(diào)，這突出了CMF 植入劑與αPD-1聯(lián)合治療乳腺癌的潛在協(xié)同作用（圖5b）。

隨后，研究人員建立乳腺癌原位小鼠模型，研究CMF植入劑聯(lián)合αPD-1對腫瘤的抑制作用（圖5e）。當(dāng)小鼠腫瘤體積超過100 mm3時(shí)進(jìn)行治療。將小鼠隨機(jī)分為7組。小動物影像學(xué)結(jié)果顯示，治療后CMF植入劑聯(lián)合αPD-1組腫瘤熒光面積最小，表明治療效果良好（圖5d）。治療后，CMF植入劑+αPD-1組平均腫瘤體積為294.7 mm3，為CMF植入劑組651.3 mm3的45.2%（圖5g，h）。CMF植入劑+αPD-1組平均腫瘤重量為202.68 mg，為CMF 植入劑組443.32 mg的45.7%。此外，治療50天后，CMF 植入劑和αPD-1組小鼠的存活率仍為100%，而CMF 植入劑組小鼠的存活率為62.5%（圖5i）。這些發(fā)現(xiàn)表明CMF植入劑治療增強(qiáng)了乳腺癌對免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）治療的敏感性。

圖5. 體內(nèi)探究CMF植入劑對乳腺癌的治療效果。

Western blot分析顯示，與cGAS-STING通路相關(guān)的下游蛋白（如phos-STING、phos-TBK1和phos-IRF3）的表達(dá)顯著增加，表明CMF 植入劑可以通過促進(jìn)mtDNA的釋放來激活cGAS-STING通路（圖6a）。酶聯(lián)免疫分析（ELISA）對不同治療組腫瘤組織中細(xì)胞因子的分析表明，CMF 植入劑治療顯著提高了腫瘤中免疫活化細(xì)胞因子（CXCL10、IFN-γ、TNF-α、IFN-β）的水平（圖6b）。因此，這些結(jié)果表明CMF 植入劑可以通過mtDNA-cGAS-STING軸和ICD激活抗腫瘤免疫應(yīng)答。在這個(gè)過程中，腫瘤內(nèi)的免疫細(xì)胞起著至關(guān)重要的作用。流式結(jié)果顯示，與對照組相比，CMF植入劑和αPD-1處理的小鼠腫瘤中CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、NK細(xì)胞和B細(xì)胞的比例更高。此外，CD8+ T細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α顯著增加（圖6c-f）。這些結(jié)果提示CMF植入劑和αPD-1可以將淋巴細(xì)胞募集到腫瘤部位，激活其抗腫瘤活性。在CMF植入劑和αPD-1處理的小鼠腫瘤中，Treg細(xì)胞和MDSCs的數(shù)量明顯低于對照組（圖6k，l）。這一變化與CMF植入劑和αPD-1等因子誘導(dǎo)的ICD和TME中IFN-γ的釋放密切相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)提示CMF植入劑和αPD-1可以改變TME中免疫細(xì)胞的組成，將“冷"腫瘤轉(zhuǎn)化為對免疫治療更敏感的“熱"腫瘤。

圖6. CMF植入劑在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫效應(yīng)的機(jī)制分析。

在原發(fā)腫瘤部位植入可產(chǎn)生較強(qiáng)的先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，顯著影響TME，具有良好的腫瘤抑制作用。在這些結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究CMF 植入劑和αPD-1對轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療作用。為模擬轉(zhuǎn)移瘤，分別建立小鼠雙側(cè)腫瘤模型和肺轉(zhuǎn)移瘤模型。雙側(cè)腫瘤模型的建立及治療方案如圖7a所示。雙側(cè)腫瘤對照組的腫瘤標(biāo)記為未治療的原發(fā)性（UP）、未治療的遠(yuǎn)處（UD）；雙側(cè)腫瘤治療組的腫瘤標(biāo)記為原發(fā)性治療（TP）和遠(yuǎn)處治療（TD）。在治療期間，治療組在原發(fā)和遠(yuǎn)處腫瘤部位的腫瘤重量均明顯減輕（圖7c），圖7d為具有代表性的腫瘤圖片。在整個(gè)治療期間，治療組腫瘤生長速度明顯受到抑制。值得注意的是，治療組的一些小鼠遠(yuǎn)端腫瘤緩解（圖7e，f）。治療后，原發(fā)和遠(yuǎn)端腫瘤中CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞和B細(xì)胞的浸潤均明顯增加（圖7g、j-m）。免疫抑制細(xì)胞（如Treg細(xì)胞和MDSCs）比例明顯降低（圖7i，o）。因此，CMF植入劑和αPD-1誘導(dǎo)的原發(fā)性TME改變明顯影響了遠(yuǎn)端腫瘤。

圖7. 分析CMF 植入劑和αPD-1對遠(yuǎn)處腫瘤的抑制作用。

小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型的建立及處理如圖8a所示。原位乳腺癌小鼠在治療期間的腫瘤體積變化如圖8c所示。對照組腫瘤發(fā)展迅速，20天左右平均腫瘤體積達(dá)到1288 mm3，而CMF植入劑+αPD-1治療組腫瘤體積僅為288 mm3。治療后的肺組織圖像顯示，對照組小鼠的肺組織呈暗紅色，組織中散布著許多乳腺癌的肺結(jié)節(jié)。相比之下，治療組小鼠肺組織呈粉紅色，乳腺癌肺結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少（圖8d）。與對照組相比，治療組肺組織中CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、NK細(xì)胞和成熟DC細(xì)胞的比例均顯著升高（圖8g）。此外，CD8+ T細(xì)胞和NK細(xì)胞的抗腫瘤活性均顯著增強(qiáng)（IFN-γ和TNF-α分泌增加）（圖8h，i）。這些發(fā)現(xiàn)表明，原發(fā)性乳腺癌的治療已經(jīng)激活了一種抗腫瘤免疫反應(yīng)，這種免疫反應(yīng)延伸到肺組織，增強(qiáng)了肺部免疫淋巴細(xì)胞的抗腫瘤能力。

圖8. CMF 植入劑和αPD-1對肺轉(zhuǎn)移瘤的抑制作用分析。

總結(jié)：研究人員開發(fā)了一個(gè)實(shí)用的藥物輸送系統(tǒng)，擴(kuò)大了穿刺針的效用。該系統(tǒng)可以在未來應(yīng)用于深部腫瘤的放射性粒子植入和抗癌藥物的精確、微創(chuàng)輸送，特別是對于晚期、轉(zhuǎn)移性或無法手術(shù)的癌癥患者。此外，研究人員設(shè)計(jì)了一種基于正反饋機(jī)制的免疫激活策略，通過腫瘤細(xì)胞代謝重編程重塑腫瘤免疫微環(huán)境，克服免疫逃避，從而促進(jìn)后續(xù)的免疫檢查點(diǎn)抑制治療。CMF植入劑代表了一種開創(chuàng)性的策略，它將工程學(xué)、材料科學(xué)和免疫學(xué)相結(jié)合，為實(shí)體瘤的治療提供了一種高效、安全、協(xié)同的局部到全身免疫解決方案。